考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測(cè)2.5μg/mL蛋白質(zhì)，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。
考馬斯亮藍(lán)G250是由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來(lái)作為蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白質(zhì)含量流程：
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1、Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml，此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3、將待測(cè)樣本溶于緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的緩沖溶液相同。
4、按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾除去。
5、每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過(guò)30min。
6、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。
